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【阿拉丁】蛋白质印迹的上样对照

作者:上海阿拉丁生化科技股份有限公司 2024-05-15T00:00 (访问量:7389)

蛋白质印迹的上样对照

 

 

自从1979年第一篇描述蛋白质印迹的出版物以来,这种免疫检测技术已经被广泛用于事变从细胞或组织中提取的复杂混合物中的特定蛋白质。蛋白质印迹具有三个基本要素:1按大小分离蛋白质,2转移到固相支持物上,3使用适当的一抗标记目标蛋白质,然后进行可视化(通常使用偶联的二抗)。随后工具和技术的改进,以及高灵敏度荧光标记的开发,有效地提高了检测极限,并使科学家能够探测组织特异性的正常和疾病。然而,科学家在使用定量蛋白质印迹法来识别蛋白质水平的变化时通常会遇到一些困难。这是由于许多蛋白质在不用组织和不同生理和病理条件下表现出不同的表达模式。

 

蛋白质印迹:一项并不简单的常规技术

尽管蛋白质印迹可能是最常用的免疫应用,单仍然存在一些可能长期被忽视的关键技术问题。例如,分离或分离方案是否会影响蛋白质或其翻译后修饰的完整性?能否区分蛋白质的讲解或聚集以及生物过程的相关产物?当结果是多个条带时,如何确定哪些是结果、变异、伪影?

 

定量蛋白质印迹可用于比较一组样品中靶蛋白的相对量,所述样品可代表不同的个体、治疗条件、疾病状态或其他生物学变量。为了准确识别和测量多个样品的总蛋白水平,科学家可以使用“上扬对照”作为内部标准。该对照是指添加针对假定存在于所有样品中的蛋白质的一抗,并且其相对丰度不受到生物变异或实验条件的影响。蛋白质靶标通常是上样对照的良好候选者,它们是普遍表达的“管家”基因产物。假设不同样品泳道之间的上样对照相同,使用上样对照可以对所有孔中的样品上样进行定量,以使结果标准化。使用上样对照还可以防止“边缘效应”,这是使用大量泳道时常见的情况,并且外侧泳道中的蛋白质转移到抹上更靠近框架的位置,从而导致在泳道上产生更强烈的染色。上样对照可用于显示蛋白质上样量是否发生变化,并可解释观察到的目标条带的变化。如果正确使用,上样对照可确保蛋白质得到正确定量,尽管蛋白质印迹所有泳道上的上样量存在细微差异。


 

选择上样对照抗体

β-肌动蛋白和β-微管蛋白一直被用作加载对照,因为它们的表达在大多数模型系统中是相对组成型的。然而,一些出版刊物质疑使用β-肌动蛋白作为标准负荷对照,理由是β-肌动蛋白和β-微管蛋白水平组织之间存在差异,并且它们的表达可能受到病理条件的影响。这些作者建议将总蛋白分析作为定量蛋白印迹中的替代技术,并建议在研究所研究基因的表达模式后应谨慎使用“管家”基因产品。尽管如此,β-肌动蛋白和β-微管蛋白作为内参抗体还是具有一定的优势:它们高度保守,表达水平高,在大多数实验条件下表现出较好稳定性。值得注意的是,必须根据所研究的特定组织或细胞类型选择对照,并且可能需要进行经验测试来验证上样对照的均匀性。

 

通过上样对照抗体获得有效结果的技巧

为了克服蛋白质印迹的变异性并减少数据解释中的错误,以下一些预防措施可能会有所帮助。

     使用稳定表达且受实验条件影响最小的内部上样对照。

     选择针对已知在样品中组成行表达的蛋白质的上样对照抗体。

     利用第二个上样对照来证实第一个对照获得的结果。对于新的或新颖的样品来说,可能特别有价值。

    上样对照应涵盖较宽的分子量范围,以便选择的对照与目标蛋白的分子量相似。这确保了可以在印迹上轻松的区分目标条带和对照条带。

    上样对照抗体通常检测大量表达的管家蛋白,导致信号饱和,特别是在使用化学发光检测方法时,过饱和可能会导致上样对照条带无法用于参考,可能会隐藏目标蛋白质量的样品间差异。

 

参考文献

1. Renart J, Reiser J, Stark GR. 1979. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76(7):3116-3120. https://doi.org/10.1073/pnas.76.7.3116

2. Dittmer A, Dittmer J. 2006. β-Actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27(14):2844-2845. https://doi.org/10.1002/elps.200500785

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5. Gorr TA, Vogel J. 2015. Western blotting revisited: Critical perusal of underappreciated technical issues. Prot. Clin. Appl.. 9(3-4):396-405. https://doi.org/10.1002/prca.201400118

 

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