Phi29 DNA聚合酶:DNA扩增和合成的多功能利器-技术前沿-资讯-生物在线

Phi29 DNA聚合酶:DNA扩增和合成的多功能利器

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-04-10T00:00 (访问量:19977)

 

phi29 DNA聚合酶是一种从Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆出来的嗜温DNA聚合酶,具有很强的链置换活性、持续合成能力和极高的保真度,是滚环扩增(RCA)和多重链置换扩增(MDA)的首选用酶。目前,它在DNA酶法合成、全基因组扩增、纳米孔测序仪开发等领域发挥着重要作用,应用潜力巨大。接下来,小编将从phi29 DNA聚合酶的结构、活性、应用等方面进行展开介绍。

 

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phi29 DNA聚合酶结构及活性

Phi29 DNA聚合酶是一种分子量约为66 kda的单体酶,该酶由多个关键结构域构成,包括核酸外切酶结构域、Thumb结构域、Palm结构域,以及两个重要的TPR结构域,具有5'-3'聚合酶活性、3'-5'核酸外切酶活性和链置换活性,在生物学研究及应用中具有广泛的应用前景。

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3’-5’核酸外切酶活性(校正活性)

Phi29 DNA 聚合酶有3’-5’核酸外切酶结构域,具备高保真(校正)活性,其保真度是Taq酶的1000倍,高于目前绝大多数高保真酶的保真度,可保证扩增反应的高保真性。

 

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聚合活性

phi29 DNA聚合酶的聚合活性源于其独特的Palm、Thumb和Fingers结构域组合,共同构建了一个高效的聚合活性区域。这种特殊的结构赋予了它5'-3'聚合酶活性,使其对单链DNA或单链RNA展现出卓越的底物亲和力和强大的持续合成能力。在单次聚合反应中,phi29 DNA聚合酶能够实现超过70kb的连续聚合延伸。

 

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链置换活性

phi29 DNA聚合酶的两个亚结构域——TPR1和TPR2的存在,使得phi29 DNA聚合酶展现出了强大的链置换活性,能够有效地解链和复制DNA的复杂结构。因此,在体外环境下,phi29 DNA聚合酶能够执行不依赖于热循环的等温DNA聚合反应,展现出其卓越的DNA复制能力。

 

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phi29 DNA聚合酶相关的主流DNA扩增技术

相较于常规DNA聚合酶,phi29 DNA聚合酶展现出了卓越的持续合成能力和链置换活性,其保真度也远超常规聚合酶。这些显著的优势使得phi29 DNA聚合酶在多种DNA扩增技术中得到了广泛应用,如多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)等。接下来,我们将详细介绍phi29 DNA聚合酶在这些主要技术中的表现和应用前景。

 

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多重置换扩增(MDA)

多重置换扩增(MDA)的核心原理在于利用随机的六聚体引物与phi29 DNA聚合酶在恒温条件下协同作用,以实现DNA的高效扩增。这一过程依赖于phi29 DNA聚合酶的持续合成能力、高保真度及链置换活性(实现等温扩增的关键)。

 

在反应过程中,六聚体引物随机结合至DNA模板之上,随后phi29 DNA聚合酶在DNA的多个位点同步启动复制过程。新合成的DNA逐步取代模板的互补链,而被置换的互补链则能够作为新的模板继续参与扩增反应。MDA凭借其能够从微量样本中产出大量高质量DNA的能力,已成为当前单细胞全基因组扩增领域最为广泛应用的技术之一。

 

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滚环扩增(RCA)

滚环扩增(RCA)是一种模拟自然界微生物环状DNA滚环复制过程的核酸扩增方法。该方法以环状DNA为模板,借助一个与部分环状模板互补的短DNA引物,在phi29 DNA聚合酶(具备强持续合成能力、高保真度及链置换活性)的催化作用下沿环状模板延伸,并持续置换先前产生的延伸链。最终,这一过程将产生重复的长单链DNA产物。通过在RCA基础上引入与延伸产物退火杂交的另一条或多条引物,还可以形成超分支RCA,实现超指数式扩增。RCA技术以其高灵敏度、良好特异性和易于操作的特性,在SNP检测、质粒体外酶促生产、DNA测序模板制备等领域具有广泛的应用潜力。

 

 

 

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phi29 DNA聚合酶相关的主流应用

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DNA酶法合成

质粒DNA,作为mRNA疫苗、DNA疫苗以及细胞基因治疗等多个领域的核心“元件”,扮演至关重要的角色。传统的质粒生产方式涉及大肠杆菌发酵和多级放大扩增过程,最终进入纯化环节。然而,发酵过程中的不可控风险因素限制了高质量质粒载体的产量,这成为了疫苗产能的关键瓶颈。


英国的Touchlight公司创新性地推出了doggybone DNA(dbDNA)载体技术。这项技术颠覆了传统的细菌发酵制备质粒DNA的方法,使体外酶法合成DNA成为可能。


这种创新方法带来了以下显著优势:

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速度快,产量高:体外酶促法仅需数周即可生产克级dbDNA(常规质粒生产通常是毫克级),比传统的细菌发酵法生产质粒DNA快5倍。

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优化载体:dbDNA可以编码更长、更复杂或更不稳定的基因,且无需细菌DNA和抗性筛选,避免生物发酵过程的诸多不可控风险。

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dbDNA体外酶法合成:

dbDNA是一种小的、线性的双链共价闭合DNA结构,其形状类似于“狗骨头”(doggybone),可以编码长片段、复杂或不稳定的DNA序列,由3个部分组成:两端的TEL序列(TelN端粒酶切割后的完全互补的闭合结构),及中间的目标DNA序列。

dbDNA体外酶法合成工艺:

 a 

模板变性

dbDNA的起始模板为环状质粒DNA,包含目标基因序列、端粒酶识别序列(telRL)和细菌骨架序列。通过变性处理,将其转化为两个单链环状DNA(图5,AB)。

滚环扩增

利用Phi29 DNA聚合酶,以单链环状DNA为模板,进行滚环扩增,生成具有端粒酶识别序列间隔的长线性双链多联体DNA(图5,CDE)。

切割及共价闭合

源自N15噬菌体的端粒酶TelN识别多联体DNA上的端粒酶识别序列(telRL)发挥切割和连接活性,生成线性、末端共价连接的mini DNA单体(图5,FG)。

去除细菌骨架DNA

端粒酶处理后的体系中包含细菌骨架序列DNA(backbone DNA)和目标基因DNA(dbDNA)两部分。细菌骨架DNA其末端具有开放结构,可通过添加限制性内切酶和核酸外切酶降解。最后,对反应体系的成分和降解的核酸片段进行纯化,得到仅含有目标基因表达元件的dbDNA。

 

这种体外DNA酶法合成技术以其独特的优势,能够巧妙地规避生物发酵过程中存在的多种不可预测和难以控制的风险。正因如此,它为众多新兴技术,如mRNA疫苗、DNA疫苗、基因治疗以及基因编辑等提供了强有力的支持,并展现出了极为广阔的应用前景。翌圣生物可提供DNA酶法合成的核心酶原料:phi29 DNA聚合酶(Cat#14404ES)及TelN端粒酶(Cat#4540ES)等,助力DNA酶法合成技术研发生产

 

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单细胞基因组测序

单细胞测序是研究细胞间差异的一种重要技术,但由于单个细胞的基因组DNA含量较低(pg级别),无法满足各大测序平台上机要求,需要通过全基因组扩增技术(WGA)来解决该问题。其中MDA是目前应用最广泛的单细胞全基因组扩增技术。其操作简单,对实验仪器的要求低,使用非预变性的模板时也可取得良好的效果,可进一步简化实验操作及避免污染的产生,广泛应用于基因组测序、SNPs 分析等相关领域。

 

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纳米孔测序仪开发

第三代测序技术是指单分子实时测序技术,也叫从头测序技术,其最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增,实现了对每一条DNA分子的单独测序。目前已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔(Nanopore)测序技术便是三代测序的代表性技术之一。

 

其优势主要有:

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长读长:Reads可达Mb;

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实时获得序列信息:最快可在1小时内完成测序流程及数据分析;

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装置便携:重量轻,体积小,可以随身携带;

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设备低成本:测序芯片可清洗再生,重复利用;

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直接测序:不需要进行PCR扩增,直接测序原始DNA和RNA,可避免扩增偏好性,保留原始碱基修饰信息,能够直接检测胞嘧啶的甲基化状态。

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纳米孔测序原理:

纳米孔测序基于电信号,核心是利用一个纳米孔,孔内共价结合特定的分子接头,将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后,利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔,当核酸分子通过纳米孔时,会引起电荷状态的变化,进而导致电阻膜上电流发生波动。纳米孔直径通常比DNA分子直径小一个数量级,保证只有一个DNA分子通过每一个纳米孔,ATCG单个碱基的带电性质不一样,因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同,通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列,从而实现测序。

 

纳米孔测序关键元件的关键元件之一是Motor——马达蛋白。在文库构建时,需要在接头上连接一种马达蛋白,用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。常见的Motor包括DNA聚合酶类的Phi29 DNA聚合酶或其变体、解旋酶类的RecD解旋酶、TraI解旋酶、Dda解旋酶等。

 

目前国内外有多家公司正在布局或已有纳米孔测序仪器上市,在仪器开发中,天然的phi29 DNA聚合酶或解旋酶,往往难以满足高标准的测序要求。为此,翌圣生物不仅可提供商业化分子酶产品(如phi29 DNA聚合酶Cat#14404ES等),还针对在测序仪器开发等应用中可能面临的市售酶或自然酶性能不足的问题,成立以酶进化技术为驱动、专注于提供酶改造定制化解决方案的子公司-镁孚泰生物(点击了解更多)。依托于翌圣生物,镁孚泰生物现有六大技术平台:ZymeEditor创新酶进化平台、多宿主高效表达平台、发酵工艺开发平台、纯化工艺开发平台、超洁净酶生产平台以及酶分析与质控平台。基于这六大技术平台,镁孚泰生物可提供酶定向改造、新酶开发、酶工艺开发以及GMP级别规模化生产的全套定制解决方案,以满足酶在体外诊断、生物医药、合成生物、医疗美容、医药中间体以及测序等领域的应用需求。

 

 

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翌圣phi29 DNA 聚合酶性能展示

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高灵敏度:可对pg级别的DNA模板进行有效扩增

 

图9.翌圣及进口品牌phi29 DNA聚合酶不同DNA模板投入量扩增结果。C1:无模板对照,C2:无酶对照。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶(Cat#14404ES)灵敏度及扩增产量优于进口品牌。

 

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高扩增产量:100ng模板投入,产量可达2 μg/μL,有利于模板DNA等规模化放大

图10. 翌圣phi29 DNA聚合酶扩增产量。模板:293细胞gDNA,投入100ng;反应时间:16h。结果显示翌圣phi29 DNA聚合酶(Cat#14404ES)在100ng模板投入量下,扩增产量可达到2 μg/μL。

 

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相关产品

 

应用分类

产品定位

产品名称

货号

酶法合成

phi29 DNA 聚合酶

phi29 DNA Polymerase (10 U/μL)

14404ES

TelN端粒酶

TelN Protelomerase (5 U/μL)

14540ES

核酸外切酶

Exonuclease III

14525ES

dNTP

dNTP Mix(25 mM each)

10125ES

焦磷酸酶

Inorganic Pyrophosphatase

10658ES

单细胞测序

单细胞逆转录

YeaCell™ 1st Strand Synthesis kit for Single Cell 3ʹRNA-seq

13594ES

单细胞/低投入量cDNA合成及扩增

Hieff NGS® Single Cell/Low Input cDNA Synthesis & Amplification Module

12500ES

单细胞RNA建库

Hieff NGS® Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit

12502ES

 

参考文献

[1] Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, et al. Insights into strand displacement and processivity from the crystal structure of the protein-primed DNA polymerase of bacteriophage phi29. Mol Cell. 2004;16(4):609-618. 

[2] Rato S, Golumbeanu M, Telenti A, Ciuffi A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 2017;239:55-68.

[3] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

[4] Rato S, Golumbeanu M, Telenti A, Ciuffi A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 2017;239:55-68.

 

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