隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测

“US-EPA Methods 1622/1623”

EPA1623方法的操作简介：

“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法。概括地说,该方法分为三部。第一，对水样进行过滤收集水中的卵囊和孢囊；第二，利用免疫磁分离来纯化过滤样品；第三，对纯化的样品通过免疫荧光显微镜法来检测“两虫”的数量。

1．水样过滤:

采用美国EPA推荐的PALL公司Envirochek-HV囊式滤器对水样进行过滤，将卵囊、孢囊及其他物质收集在过滤器上。该过滤器可用于实验室批量水样的过滤，也可以用于野外现场水样的过滤。过滤后的囊式滤器，用洗脱剂将拦截在滤囊上的颗粒物质震荡洗脱下来，并将洗脱物收集在一个250毫升的离心管中。（详见第2页）

2. 免疫磁分离：

离心管中的洗脱物通过离心分离作用，使颗粒物沉淀在离心管底部，同时去掉离心管中的上清液。

将离心后含有卵囊和孢囊的沉淀物用纯水混匀，并向其中加入Dynal公司的免疫磁分离试剂（Dynabeads GC-Combo试剂盒）进行磁分离。具体做法是：首先用带有抗体（抗隐孢子虫和抗贾第鞭毛虫）的特殊磁珠捕获沉淀物中的卵囊和孢囊；其次通过Dynal公司的MPC-1、MPC-S磁粒浓缩器将捕获有卵囊和孢囊的磁珠吸附在试管壁上，去掉未被吸附在试管壁上含杂质的液体，以达到卵囊和孢囊从沉淀物中分离出来的目的；再次加入盐酸将管壁上捕获有卵囊和孢囊的磁珠进行洗涤，以使卵囊和孢囊从磁珠上解离出来；最后将含有卵囊和孢囊的纯化液转移至井形载玻片上进行制片。

3. IFA 染色 & 镜检：

待井形载玻片上的纯化液干后，用NaOH中和井形载玻片上样品，再用Dynal公司的Aqua-GloTMG/C染色试剂盒，将卵囊和孢囊在井形载玻片上用磁荧光标记的单性抗体和DAPI溶液着色后，盖上盖玻片。然后用OLYMPUS荧光和差分干涉相衬（DIC）显微镜对着色样本进行检测。

观察样片，对符合卵囊和孢囊大小、外形、荧光特性的对象进行定性、定量分析。

隐孢子虫和贾第鞭毛虫的纯化

—免疫磁分离技术—

1999年美国环保署在EPA1623方法中规定利用IMS(Immuo Magnetic Separation)免疫磁分离技术Dynabeads^®来分选检测饮用水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊，其原理是：利用带有特异性抗体的磁珠与样品中的目标产物G/C特异性抗原相结合，在磁场中高效选择性分离。

研究型正置荧光生物显微镜系统：

本实验中所配备的OLYMPUS正置荧光生物显微镜可以很好地完成明场和暗场显微观察，具有良好的可靠性、稳定性和实验室广泛应用等特性。

显微镜数码照相部分所配备的数码照相机，为专业应用的高清晰度数码相机，采用不同于民用的图像数据采集体及系统，此款相机成像最高可达到1200万像素级别，并且在适用明场拍摄的同时可以可靠、稳定地完成荧光图象、暗场等特殊拍摄的要求，对实验图像数据的记录、再现和分析提供了很好的可能和保障；该相机的相关系统是目前应用比较普遍、性能比较优越的；如出现问题也方便修理和更换配件。配备微机及彩色打印系统效果最佳。