产品内容
试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。 
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。 
试剂三：液体 1mL×1 瓶，-20℃保存。 
试剂四：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。 
试剂五：液体 5 mL×1 瓶，4℃保存。 
试剂六：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 4.5mL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。 NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD，NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联， 蓝色的 DCPIP 被还原为无色的 DCPIP，在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化 酶活性的大小。 
自备仪器和试剂  可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研 钵、冰、蒸馏水
操作步骤
一、样品测定的准备： 
1、 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 
2、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵 匀浆。 
3、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。 
4、 将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 
5、 将上清液转移至另一 EP 管中，用于线粒体中泄露 NOX 活性测定。 
6、 沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，用于 NOX 活性测定。 
7、 NOX 总酶活即为上清中 NOX 活性与沉淀中 NOX 活性之和。
 二、测定步骤和加样表： 
1、可见分光光度计预热 30min 以上； 
2、试剂四 37℃保温放置。
试剂名称（μL）
测定管
对照管
试剂四
175
175
试剂五
25
25
样本
10
10
蒸馏水
 
40
试剂六
40
 
将上述试剂按顺序在 1mL 玻璃比色皿中操作，加入试剂六后立即混匀，同时开始计时，在 600nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 1 分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录 1 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A1-A2，记录 A 测定、A 对照，ΔA1=ΔA 上清测定-ΔA 上清对照，ΔA2=ΔA 沉淀测定-ΔA 沉淀对照。
三、NOX 活力单位的计算： 
（一）用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下 
A、上清中 NOX 活力的计算: 
1、组织中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(Cpr 上清×V 样本)=2500×ΔA1÷Cpr 上清 
（2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/g 鲜重）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)=2525×ΔA1÷W 
2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(Cpr 上清×V 样本)=2500×ΔA1÷Cpr 上清 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(500÷V 提取×V 样本)=5.05×ΔA1 V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样本：加入样本体积，0.01mL；V 提取：加入提取液体积，1.01mL； Cpr 上清：上清中蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500 万。 
B、沉淀中 NOX 活力的计算:
 1、组织中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(Cpr 沉淀×V 样本)=2500×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/g 鲜重）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样本)=505×ΔA2÷W 
2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(Cpr 沉淀×V 样本)=2500×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(500÷V 样总×V 样本)=1.01×ΔA2 V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样本：加入样本体积，0.01mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202mL； Cpr 沉淀：沉淀重悬后蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500 万。 
C、样本 NOX 总活力的计算: 样本 NOX 总活力即为上清中 NOX 活力与沉淀中 NOX 活力之和。 
1、组织中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr 上清+2500×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按样本鲜重计算： NOX（U/g 鲜重）=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W
 2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算：
 （1）按样本蛋白浓度计算： NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr 上清+2500×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=5.05×ΔA1+1.01×ΔA2
 
 （二）用 96 孔板测定的计算公式如下 
A、上清中 NOX 活力的计算: 
1、组织中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(Cpr 上清×V 样本)=5000×ΔA1÷Cpr 上清 
（2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/g 鲜重）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)=5050×ΔA1÷W 
2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(Cpr 上清×V 样本)=5000×ΔA1÷Cpr 上清 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(500÷V 提取×V 样本)=10.10×ΔA1 V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样本：加入样本体积，0.01mL；V 提取：加入提取液体积，1.01mL； Cpr 上清：上清中蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500 万。
 B、沉淀中 NOX 活力的计算: 
1、组织中 NOX 活力的计算：
 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(Cpr 沉淀×V 样本)=5000×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/g 鲜重）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样本)=1010×ΔA2÷W 
2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(Cpr 沉淀×V 样本)=5000×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(500÷V 样总×V 样本)=2.02×ΔA2 V 反总：反应总体积，0.25mL；V 样本：加入样本体积，0.01mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202mL； Cpr 沉淀：沉淀重悬后蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500 万。 
C、样本 NOX 总活力的计算: 样本 NOX 总活力即为上清中 NOX 活力与沉淀中 NOX 活力之和。 
1、组织中 NOX 活力的计算： 
（1）按样本蛋白浓度计算： NOX（U/mg prot）=5000×ΔA1÷Cpr 上清+5000×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按样本鲜重计算： NOX（U/g 鲜重）=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W 
2、细菌或培养细胞中 NOX 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： NOX（U/mg prot）=5000×ΔA1÷Cpr 上清+5000×ΔA2÷Cpr 沉淀 
（2）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/10 4 cell）=5.05×ΔA1+1.01×ΔA2 
注意事项： 
1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。 
2、比色皿中反应液的温度最好保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 
4、实验时，试剂六样本在冰上放置，以免变性和失活。 
5、因通过反应速率计算酶活，使用 96 孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。
 
相关文献：
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