前 言

提高蛋白质功能及其稳定性，对合成生物学、生物制药等产业具有重要意义。通过引入定点突变，改变蛋白质中某个位置的氨基酸，可以提升蛋白质的结构、稳定性或催化性能。

无细胞蛋白质合成技术利用从细胞中分离的翻译机制进行模板基因的体外表达。由于无细胞蛋白质合成系统无需基因克隆和细胞培养步骤即可产生蛋白质，因此可作为酶库高通量表达的通用平台。运用无细胞蛋白合成技术，可以在微孔板中高通量合成相应蛋白，与后续基于微孔板的高通量检测步骤能够无缝衔接，从而实现包括基因构建、蛋白表达、检测筛选在内的全流程高通量蛋白快速筛选。此外，无细胞蛋白质合成不需要维持细胞活力或膜完整性，因此可以更灵活地设计酶结构，提升酶活性 [1]。

珀罗汀生物基于自主研发的无细胞蛋白技术，利用无细胞蛋白表达试剂开发了高通量筛选应用场景，技术团队以绿色荧光蛋白(GFP)为模型，在 13 小时内完成了近百个定点突变蛋白的高通量制备及表达验证，快速获得高性能的蛋白突变体。

实验方法

定点突变

首先我们向GFP原始基因序列中分别引入95种定点突变(图1)。通过使用带有突变基因的引物对原始模板进行PCR的方式，将突变引入PCR产物当中，再用Dpn I 酶将原始模板质粒降解后，使用Seamless法将线性模板重新连接为环状。达到获得环状且带有突变氨基酸蛋白基因的目的。

图1. 定点突变基因表达载体的构建流程

无细胞蛋白表达反应

构建完成突变基因载体后，我们进一步对载体进行体外扩增和高通量蛋白表达(图2)。取少量连接完的带有突变的环化模板，按照推荐的步骤，进行线性模板的PCR扩增。将扩增后的线性模板加入无细胞蛋白反应液后，进行无细胞反应。该步骤极大的减少了蛋白表达所需求的时间，在2-8h内就能在反应体系中生成目的蛋白。该技术操作简便，极易与自动化工作站相结合。同时由于没有细胞膜的限制，离心后的表达上清即可进行后续酶的活性检测，进一步简化实验流程以达到节约人力及时间成本的目的。

图2.突变基因扩增与无细胞蛋白表达

整体操作流程

通过上述方法，即可在13小时以内，完成近100个突变蛋白的基因构建、表达筛选。其中人工操作时间累计仅30分钟，占全部时间的比例不到4%。运用无细胞蛋白表达技术，结合PCR、光学检测等，实现了全流程的体外高通量筛选实验，显著了缩短了实验时间，减少了人员工作量，这为加快研发周期，降低人力成本提供可能。

图3.无细胞蛋白表达筛选流程的时间与试剂成本分析

突变体筛选结果

我们在绿色荧光蛋白活性中心的5个位点上(第64-69位氨基酸)，分别引入定点突变，每个位点均包括了所有可能的氨基酸(19种)，总计95种突变体。我们在96孔板上完成了基因构建、蛋白表达和荧光检测分析，通过荧光信号检测，我们获得95种突变体对应的荧光值(图4)。突变相应位点氨基酸能显著改变蛋白的荧光特性。我们发现将GFP第66位的酪氨酸替换为组氨酸，原来的绿色荧光波长发生蓝移(图5)，有成为eBFP(增强型蓝色荧光蛋白)的潜力。将GFP第66位的酪氨酸替换为色氨酸，同样也能使得GFP的荧光波谱蓝移，但蓝移幅度略低于前述替换为组氨酸(图6)，故该突变体有成为eCFP(增强型青色荧光蛋白)的潜力。

图4.定点突变GFP在535nm波长的绿色荧光强度

图5.定点突变GFP的450nm波长的蓝色荧光强度

图6.定点突变GFP的480nm波长的青色荧光强度

总结及展望

通过上述实验，珀罗汀生物展示了一种运用无细胞蛋白表达技术，高通量筛选验证点突变蛋白的方法。该方法在13小时内完成了近百种突变蛋白的构建表达及活性验证，显著缩短了蛋白筛选的时间，减少了人工操作，提高了研发效率。蛋白生物活性、稳定性的不断提升，对于蛋白类产品在医疗、农业、造纸、纺织、生物能源、家庭护理等方面推广应用，有着举足轻重的作用。运用无细胞蛋白表达技术，能够更高效快速地完成蛋白质改造与筛选，缩短酶制剂、蛋白药物等各类蛋白产品的研发周期，降低研发成本，从而促进新型重组蛋白、酶、抗体等蛋白产品快速的发展。

珀罗汀生物作为一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司，将继续利用无细胞蛋白表达技术优势，开发更为广泛的应用场景。